Исследование агрегационной способности тромбоцитов

Повышение агрегации – маркер гиперагреационного синдрома и тромбофилий. Наиболее часто используются турбидиметрический метод Борна, основанный на регистрации изменений светопропускания обогащенной тромбоцитами плазмы и метод исследования агрегации тромбоцитов, основанный на анализе флуктуаций светопропускания, вызванных случайным изменением числа частиц в оптическом канале.

Материал для исследования.

Цитратная богатая тромбоцитами плазма

Метод исследования

определяется порядком работы на том или ином типе агрегометра.

В качестве индукторов наиболее часто используют растворы АДФ, ристоцетина, коллагена, адреналина, арахидоновой кислоты. Также могут использоваться растворы тромбина, серотонина и др.

Агрегация тромбоцитов с АДФ

Воздействие малых доз АДФ (обычно 1*10-7 моль) приводит к формированию двойной волны агрегации. Первая фаза (первичная волна) зависит от добавленного экзогенного АДФ, а вторая фаза (вторичная волна агрегации) возникает за счет реакции высвобождения собственных агонистов, содержащихся в гранулах тромбоцитов. Большие дозы АДФ (обычно 1*10-5 моль) приводят к слиянию первой и второй волн агрегации.

При анализе агрегатограмм обращают внимание на общий характер агрегации (одноволновая, двухволновая; полная, неполная; обратимая, необратимая) и скорость агрегации. Появление двухволновой агрегации при стимуляции АДФ в концентрациях, вызывающих в норме обратимую агрегацию (обычно 1-5 мкмоль), указывает на повышение чувствительности тромбоцитов, а развитие одноволновой неполной (а часто и обратимой) агрегации при стимуляции АДФ в концентрациях 10 мкмоль и больше – на нарушение реакции высвобождения тромбоцитов.

Агрегация тромбоцитов с ристоцетином

Определение агрегации тромбоцитов с ристоцетином в плазме применяют для количественной оценки фактора Виллебранда. В основе метода лежит способность ристоцетина стимулировать in vitro взаимодействие фактора Виллебранда с тромбоцитарным гликопротеидом Ib. В большинстве случаев болезни Виллебранда отмечается нарушение ристоцетин-агрегации при нормальном ответе на воздействие АДФ, коллагена и адреналина. Нарушение ристоцетин-агрегации выявляют и при болезни Бернара-Сулье. Для дифференциации применяют тест с добавлением нормальной плазмы: при болезни Виллебранда после добавления нормальной плазмы ристоцетин-агрегация нормализуется, в то время как при синдроме Бернара-Сулье этого не происходит. Индуцированная ристоцетином агглютинация тромбоцитов снижена при большинстве случаев болезни Виллебранда, кроме типа IIВ.

Для оценки тромбоцитарного компонента гемостаза подсчитывают число тромбоцитов в крови. Патология тромбоцитов является причиной кровоточивости почти в 80 % случаев. При этом тромбоцитопения – наиболее частое ее проявление. Констатировать тромбоцитопению следует в тех случаях, когда количество тромбоцитов составляет менее 150 × 109/л. Длительность кровотечения – важный скрининговый тест, основное достоинство которого состоит в том, что он позволяет одновременно качественно оценить количество тромбоцитов в крови, их адгезивные и агрегационные функции, функциональные свойства стенки кровеносных сосудов, а также выраженный дефицит плазменных факторов свертывания (например, факторов VIII и IX, недостаток которых является причиной гемофилии А и В). Удлинение времени кровотечения отражает нарушение гемостаза вследствие тромбоцитопений, тромбоцитопатий (нарушения функций тромбоцитов – адгезии и агрегации), нарушений сосудистой стенки или сочетания этих факторов. Удлинение времени кровотечения при нормальном количестве тромбоцитов в крови позволяет предположить нарушение их функций. В этом и состоит основная ценность теста, т.к. для оценки адгезивных и агрегационных свойств тромбоцитов в лабораторных условиях необходимо сложное и дорогое оборудование (агрегометр). Когда функции тромбоцитов не нарушены, время кровотечения остается в норме даже при снижении числа тромбоцитов до 100,0 x 109/л. При количестве тромбоцитов ниже этого уровня время кровотечения постепенно увеличивается в линейном соотношении с числом тромбоцитов. Спонтанные кровотечения возникают, если количество тромбоцитов становится ниже 50,0 x 109/л, смертельное кровотечение почти неизбежно, если количество тромбоцитов снижается до 5,0 x 109/л. Длительность кровотечения увеличивается при следующих состояниях:

• Выраженных тромбоцитопениях;
• Нарушении функции тромбоцитов – тромбоцитопатиях, которые бывают врожденными (синдром Бернара-Сулье) и приобретенными (пернициозная анемия, острый и хронический лейкоз, миеломная болезнь, длительный прием аспирина);
• Выраженном снижении плазменных факторов свертывания;
• При нарушении резистентности стенки капилляров (недостаток витамина С, дефектах сокращения капилляров – микроангиопатиях).

Укорочение времени кровотечения диагностического значения не имеет и чаще всего бывает следствием технической ошибки при проведении теста или свидетельствует о повышенной спастической способности капилляров. Оценить склонность к тромбообразованию по данным теста длительности кровотечения невозможно. Повышенное количество тромбоцитов в крови – тромбоцитоз, несет с собой риск повышения свертываемости и проявляется тромбозами. В клинических ситуациях риск тромбоза становится реальным, если количество тромбоцитов достигает значений 1000,0 x 109/л.

Исследование агрегационных функций тромбоцитов Процессы агрегации изучают с помощью агрегометра, отражающего ход агрегации графически в виде кривой; в качестве стимулятора агрегации часто используют АДФ, адреналин и коллаген.

Нарушения агрегации тромбоцитов при различных заболеваниях (по результатам исследований на агрегометре)

Примечание: (+,-) – диагностического значения не имеет.

Патология тромбоцитов является причиной кровоточивости почти в 80 % случаев. При этом тромбоцитопения – наиболее частое ее проявление. Констатировать тромбоцитопению следует в тех случаях, когда количество тромбоцитов составляет менее 150 × 109/л. Различают острую и хроническую тромбоцитопению. Последняя диагностируется тогда, когда продолжительность ее превышает 6 мес. У лиц с уровнем тромбоцитов выше 50×109/л редко наблюдается кровоточивость. Тем ни менее, снижение тромбоцитов ниже 100×109/л может сопровождать серьезную патологию. В связи с этим причину каждого случая тромбоцитопении необходимо выяснять. При тромбоцитопениях, тяжелых тромбоцитопатиях и при дефиците фактора Виллебранда (ФВ) значительно удлиняется время кровотечения. Кровоточивость связана с недостаточностью адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов – нарушением образования в поврежденных сосудах тромбоцитарной пробки. Это может быть обусловлено либо значительным снижением количества тромбоцитов в крови, либо их дисфункцией, в основе которой чаще всего лежит отсутствие или блокада на мембране тромбоцитов рецепторов, взаимодействующих со стимуляторами (агонистами) агрегации этих клеток (ФВ, адреналином, АДФ, фибриногеном, арахидоновой кислотой и простагландинами), либо отсутствием в тромбоцитах или нарушением выхода из них компонентов гранул, содержащих эти стимуляторы агрегации. Современные гематологические анализаторы выводят тромбоцитометрические кривые (гистограммы распределения тромбоцитов по объему). Отмечается связь размера тромбоцитов с их функциональной активностью, содержанием в гранулах тромбоцитов биологически активных веществ, склонностью клеток к адгезии, изменениями объема тромбоцитов перед агрегацией. Наличие в крови преимущественно молодых форм тромбоцитов приводит к сдвигу гистограммы вправо, старые клетки располагаются в гистограмме слева, так как, по мере старения тромбоцитов их объем уменьшается. Увеличение содержания юных форм тромбоцитов наблюдается при кровопотере и свидетельствует об усиленной регенерации. Увеличение содержания старых форм, вакуолизированных тромбоцитов, форм раздражения и уменьшение содержания зрелых тромбоцитов, характерны для различных воспалительных процессов, интоксикаций, злокачественных новообразований.

Тромбомодулин – интегральный мембранный белок, рецептор тромбина, находящийся на клетках эндотелия кровеносных сосудов и участвующий в системе антикоагуляции. Он определяет скорость и направление процесса гемостаза, активно ограничивает и регулирует свёртывание крови. Эндотелий, образуя тромбомодулин, блокирует активные коагулянты, выделяющиеся печенью и находящиеся в плазме крови, в первую очередь — самый активный фактор свертывания — тромбин. Связанный тромбин исключается из системы свёртывания крови. Тромбин, присоединившись к тромбомодулину, приобретает новые качества: образует вместе с противосвертывающими протеинами С и S (кофактор протеина S) антиагрегантный и антитромботический комплекс, который препятствует свертыванию и тормозит фибринолиз. Таким образом система тромбомодулин-протеин С выполняет антикоагулянтную функцию. Более того, модифицированный при взаимодействии с тромбомодулином, тромбин, теряет способность превращать фибриноген в фибрин и вызывать агрегацию тромбоцитов. При повреждении сосудистой стенки тромбомодулин «отделяется» от эндотелия и поступает в кровь. Увеличение его в крови наблюдается у больных с претромботическими состояниями, васкулитами и т.д. Степень увеличения тромбомодулина в крови имеет диагностическое и прогностическое значение. Тромбомодулин значительно снижен при некоторых заболеваниях, таких как атеросклероз, что может увеличивать свёртываемость крови и повышать риск тромбоза.

Фактор Виллебранда – сложный мультимерный адгезивный гликопротеин, носитель-стабилизатор прокоагулянтного протеина F VIII:C, который является белком адгезии в процессах гемостаза. Фактор Виллебранда может связывать коллаген и, возможно, другие эндотелиальные структуры и опосредует адгезию тромбоцитов к субэндотелию через связывание поверхностного рецептора тромбоцитов гликопротеина Ib. Адгезия тромбоцитов, опосредованная Фактором Виллебранда, происходит наиболее интенсивно при высоких скоростях сдвига, т.е. в артериях. VIII-vWF является также носителем F VIII – антигемофильного глобулина А. Фактор Виллебранда у здоровых людей предотвращает рост тромба в сосудах, активируя образования плазмина. Повышенные уровни активности Фактора Виллебранда являются индикатором повреждения эндотелия при сосудистых заболеваниях, что может быть существенно для гипертензионных сосудистых осложнений. Болезнь фон Виллебранда – врождённый геморрагический диатез. В легкой форме эта болезнь является самым частым геморрагическим нарушением у мужчин, с частотой 1:100. Это заболевание гетерогенной природы, вызываемое либо дефектами структуры белка, либо снижением концентрации Фактора Виллебранда. Классификация заболевания основана на клинической картине, анамнезе и результатах лабораторного анализа, включая время свёртывания и определение антигена и активности Фактора Виллебранда. Определение уровня Фактора Виллебранда помогает в дифференциальном диагнозе двух основных типов заболевания: типа 1 и типа 2. Определение типа болезни принципиально, так как от этого зависит выбор тактики ведения больного.

Фибронектин является рецептором для фибринстабилизирующего фактора. Способствует адгезии тромбоцитов, участвуя в образовании белого тромба; связывает гепарин. Присоединяясь к фибрину, фибронектин уплотняет тромб. Под действием фибронектина клетки гладких мышц, эпителиоцитов, фибробластов повышают свою чувствительность к факторам роста, что может вызвать утолщение мышечной стенки сосудов (сужение диаметра).

Агрегация тромбоцитов с коллагеном

Агрегация тромбоцитов с коллагеном имеет достаточно выраженную латентную фазу, во время которой происходит активация фосфолипазы С. В зависимости от концентрации используемого реагента продолжительность этой фазы может составлять 5-7 минут. После завершения этого периода в тромбоцитах происходят процессы, приводящие к образованию вторичных посредников, вследствие чего развивается секреция тромбоцитарных гранул и синтез тромбоксана А2, что сопровождается резким усилением межтромбоцитарного взаимодействия.

В лабораторно-клинической практике коллаген чаще всего используют в конечной концентрации 50 мкг/мл, однако коллагены разных фирм могут обладать различной активностью, что необходимо учитывать при их применении.

Индуцированная агрегация с адреналином

Описание Тромбоциты играют значимую роль в жизни человека: они предотвращают потерю крови, соединяясь друг с другом на стенке поврежденного сосуда. Этот процесс – склеивания тромбоцитов – и называется агрегацией. Важно, чтобы данный параметр не отклонялся от значений нормы, иначе это чревато кровопотерей или образованием тромба, способного перекрыть весь диаметр сосуда и привести к отмиранию тканей.

Важно, чтобы данный параметр не отклонялся от значений нормы, иначе это чревато кровопотерей или образованием тромба, способного перекрыть весь диаметр сосуда и привести к отмиранию тканей.

Агрегация тромбоцитов: что это такое?

Процесс агрегации тромбоцитов в конгломераты состоит в следующем: при травме сосуда тромбоциты соединяются с фактором Виллебранда и коллагеном субэндотелиального слоя.

Агрегация тромбоцитов с коллагеном вызывает активацию красных клеток крови, причем они становятся источниками компонентов, стимулирующих агрегацию: тромбоксана и серотонина. Дезагрегация тромбоцитов – это обратный агрегации процесс.

Агрегация тромбоцитов – это защитная функция организма, но и она подвержена влиянию патологических реакций.

С одной стороны, агрегация тромбоцитов спасает нас от избыточной кровопотери, что актуально при хирургических операциях, обширных травмах и родах, с другой – гиперагрегация приводит к образованию тромба.

Тромбы очень опасны: их перемещения по кровеносной системе в сердце, головной мозг или легочную артерию могут привести к быстрой смерти. Исследование агрегации тромбоцитов учитывает их способность к соединению: при отклонениях выше нормы возможно появление инфаркта или инсульта, ниже нормы – кровопотеря, анемия, истощение.

Что такое агрегация тромбоцитов в крови? Чтобы определить значение агрегации тромбоцитов, надо сдать анализ крови из вены в пробирку, а в таком случае, когда нет раны, необходимо создать условия для объединения тромбоцитов в конгломерат.

Для этого в лаборатории внедряется индуцированная агрегация тромбоцитов.

Условия становятся максимально близкими к среде организма, в качестве индуктора агрегации тромбоцитов берутся вещества, идентичные по химическому составу человеческим, способные вызывать тромбообразование.

Индукторами могут быть:

• Серотонин.
• Коллаген.
• Адреналин.
• Арахидоновая кислота.
• Аденозиндифосфат (АДФ).

Способ измерения агрегации тромбоцитов заключается в пропускании света через плазму крови.

Различие между световой плотностью плазмы до момента свертывания крови и после образования сгустка и есть агрегационная активность тромбоцитов. Дополнительно определяют скорость агрегации тромбоцитов за 1 минуту, форму и тип волн.

Спонтанная агрегация тромбоцитов рассчитывается без использования индуктора.

Степень агрегации тромбоцитов:

• норма с АДФ – 30,7 – 77,7%
• с коллагеном – 46,4 — 93,1%
• с адреналином – 35 — 92,5%

Подготовка к сдаче анализа

Достоверная оценка результата может быть получена в случае соблюдения следующих условий: Не кушать за 12 часов до сдачи анализа. За день до забора крови не выполнять физические нагрузки и не испытывать эмоциональные потрясения.

За 7 дней до анализа остановить прием ряда лекарственных препаратов (если это невозможно, то сообщить об этом медсестре).

За день до анализа исключить алкоголь, курение, употребление чеснока и кофе. На сдачу крови приходить здоровым, без воспаления в организме.

Отклонение от нормы

Снижение агрегации тромбоцитов может происходить по следующим причинам:

• Наличием тромбоцитопатии.
• Лечением антиагрегантными средствами.

Тромбоцитопатия – заболевание, при котором нарушены функции тромбоцитов (свертываемость, тромбообразование). Проявляется болезнь наличием синяков, кровотечениями, что приводит впоследствии к малокровию.

Если агрегация тромбоцитов снижена, то назначается медикаментозное лечение, которое должен осуществлять квалифицированный специалист.

Повышенная агрегация тромбоцитов может быть при:

• Гипертонии.
• Атеросклерозе суставов.
• Инсульте и инфаркте.
• Сахарном диабете.
• Тромбозе.

Если агрегация тромбоцитов повышена, то не обойтись без консервативной терапии с применением антиагрегантных средств. Обязательно посещать врача для сдачи анализов и получения рекомендаций по лечению.

Во время беременности возможно отклонение от нормальных значений агрегации тромбоцитов.

Пониженный уровень говорит об опасности кровотечений, повышенный — проявляется при токсикозе в результате потери жидкости организмом и чреват выкидышем.

При беременности степень агрегации тромбоцитов: норма – 30-60% для любого индуктора. Анализ на агрегацию тромбоцитов назначается в случае осложненной беременности, плохого анамнеза и перед плановым зачатием.

Агрегация тромбоцитов с адреналином

Адреналин при контакте с тромбоцитами взаимодействует с α2-адренорецепторами, что вызывает ингибирование аденилатциклазы. Не исключено, что механизм, лежащий в основе реализации эффекта адреналина и развития первой волны агрегации, не зависит от образования тромбоксана А2, реакции высвобождения или синтеза фактора агрегации тромбоцитов, а связан со способностью адреналина прямо изменять проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция. Вторая волна агрегация возникает как результат реакции высвобождения и продукции тромбоксана А2.

Что такое «агрегация тромбоцитов»

Тромбоциты представляют собой бесцветные кровяные клетки, функция которых — защита организма от кровопотерь. Когда ткани организма повреждаются, тромбоциты мгновенно устремляются к месту повреждения и блокируют его, предотвращая чрезмерную кровопотерю. Такая блокировка осуществляется за счет того, что тромбоциты мгновенно склеиваются между собой, образуют блок, который закрывает рану. Это процесс блокировки и называется агрегацией тромбоцитов. Процесс происходит в два этапа:

1. Кровяные тельца слипаются между собой,
2. Позже пристают к стенкам сосуда, образуется сгусток крови, тромб.

Когда организм здоров, эта функция носит защитный характер. Но если в организме пошли патологические изменения, образования тромбов способно нарушить питание в жизненно важных органах и тканях.

Агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой

Арахидоновая кислота – природный агонист агрегации, причем ее действие опосредовано эффектами простагландинов G2 и H2, тромбоксана А2, и включает активацию как фосфолипазы C с последующим образованием вторичных посредников, мобилизацией внутриклеточного кальция и расширением процесса активации клеток, так и фосфолипазы А2, что непосредственно приводит к освобождению эндогенной арахидоновой кислоты. Агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой происходит достаточно быстро, поэтому кривая, характеризующая этот процесс, чаще носит одноволновый характер.

Для индукции агрегации кровяных пластинок арахидоновую кислоту используют в концентрациях 10-3-10-4моль. При работе с арахидоновой кислотой следует учитывать, что на воздухе это вещество очень быстро окисляется.

Пробу на агрегацию с арахидоновой кислотой рекомендуют проводить в случаях использования лекарственных средств, влияющих на реакцию агрегации (например, ацетилсалициловая кислота, пенициллин, индометацин, делагил, диуретики), что нужно учитывать при оценке результатов исследований.